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全基因組甲基化助力胰腺癌治療分子機制研究

2019-11-27

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文章題目:

C-Src confers resistance to mitotic stress through inhibition DMAP1/Bub3 complex formation in pancreatic cancer

發表期刊:

Molecular Cancer

技術手段:

 ChIP、WGBS、LC-MS/MS、表達譜等

派森諾生物與上海交通大學攜手合作,于2018年12月在《Molecular Cancer》上發表了有絲分裂應激下胰腺癌細胞的生存相關機制的研究成果,影響因子10.679。


研究背景


有絲分裂上的染色質修飾與隨后的細胞周期中的轉錄激活密切相關。作者認為該過程受致癌信號的調節,這將有助于胰腺癌的有絲分裂應激抗性。本文中顯示DMAP1 / Bub3復合物介導有絲分裂應激誘導的細胞凋亡,而這種作用在胰腺癌細胞中被c-Src抵消。該研究旨在揭示在正常細胞和胰腺癌細胞之間對有絲分裂應激不同反應的潛在機制。


研究方法


通過分子和細胞生物學方法確定Bub3和DMAP1在有絲分裂應激信號轉導中的相互作用。研究了c-Src對DMAP1 / Bub3介導的DNA甲基化和基因轉錄譜的抑制作用。分析了c-Src介導的DMAP1磷酸化與體內紫杉醇活性和臨床病理特征之間的關系。

研究結果


有絲分裂阻滯誘導Ser211處Bub3的p38依賴性磷酸化,從而促進DMAP1 / Bub3相互作用。TAp73將DMAP1 / Bub3復合物募集到抗凋亡基因BCL2L1的啟動子,從而介導DNA甲基化并抑制與細胞凋亡相關的基因轉錄。同時,DMAP1在Tyr 246處被c-Src在胰腺癌細胞中高度磷酸化,這阻礙了DMAP1 / Bub3相互作用和相關的細胞活化。阻斷DMAP1 pTyr-246可增強紫杉醇抑制的腫瘤生長。在臨床上,DMAP1 Tyr 246磷酸化與人類胰腺癌標本中的c-Src活性和胰腺癌患者的不良預后相關。


1、在有絲分裂停滯期間,Bub3與DMAP1相互作用。

免疫沉淀和質譜分析(圖1a,右圖)表明,有絲分裂阻滯極大地促進了Bub3和DNA甲基轉移酶1(DNMT1)相關蛋白DMAP1之間的相互作用。通過使用分別針對Bub3和DMAP1的抗體進行共免疫沉淀分析,進一步驗證了內源性Bub3和有絲分裂阻滯下DMAP1之間的相互作用(圖1b);雖然DNMT1缺失對DMAP1和Bub3之間的相互作用沒有影響,但DMAP1的消耗導致Bub3/DNMT1復合物的形成顯著減少(圖1c),表明DMAP1介導有絲分裂阻滯下Bub3-DNMT1復合物的形成。細胞系實驗表明有絲分裂停滯只導致了輕度的增加DMAP1/Bub3在癌細胞中的相互作用(圖1d),推測某些癌癥特異性信號參與了調控Bub3/DMAP1復合物的形成;隨后證明在胰腺癌中高活性的c-Src在Bub3 / DMAP1相互作用中起負作用。通過構建Bub3的一系列氨基酸截短圖,并在有絲分裂阻滯的HPDE細胞中進行的免疫共沉淀分析,確定了與DMAP1結合區范圍(圖1f)。

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圖1 在有絲分裂停滯期間,Bub3與DMAP1相互作用


2、 p38在Ser211磷酸化Bub3并促進Bub3/DMAP1相互作用。

Bub3 / DMAP1相互作用是磷酸化依賴性的,有絲分裂阻滯誘導的Bub3 / DMAP1相互作用被SB203580(p38抑制劑)處理特異性破壞(圖2b)。一致的是,用SB203580進行的預處理在具有c-Src抑制作用的情況下很大程度上阻斷了細胞中有絲分裂阻滯誘導的Bub3 / DMAP1相互作用(圖2c)。這些結果表明p38活性是Bub3 / DMAP1相互作用所必需的。免疫共沉淀分析也表明,有絲分裂阻滯促進了兩種細胞(圖2d)中p38與Bub3的結合。體外蛋白質磷酸化分析和Scansite分析預測了Bub3的氨基酸序列中兩個潛在的p38磷酸化殘基。掃描位點分析 (圖2f,左側)和進一步的體外蛋白磷酸化分析表明,只有進化上保守的Ser 211突變為丙氨酸,才能消除p38介導的Bub3磷酸化,這一點在使用特定的Bub3 Ser-211抗體的放射自成像和免疫印跡分析中得到了證實。GST拉檢結果表明,p38介導的Bub3 S211磷酸化足以使其與DMAP1結合((圖2g),在有絲分裂脅迫下,p38介導的Bub3 S211磷酸化是其與DMAP1結合所必需的。

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圖2  p38在Ser211位點磷酸化Bub3并促進Bub3/ dmap1相互作用


3、C-Src使Tyr246處的DMAP1磷酸化并破壞Bub3 / DMAP1復合物的形成。

c-Src在整個細胞周期中始終與DMAP1相關,而與Bub3無關,且通過Scansite分析,在DMAP1氨基酸序列上發現了許多潛在的Src磷酸化位點;進化上保守的Tyr 246突變為苯丙氨酸的突變消除了Src介導的DMAP1磷酸化(圖3a,b)。c-Src介導的DMAP1磷酸化阻礙了Bub3 / DMAP1的相互作用。GST拉檢數據(圖3d,e)表明c-Src使DMAP1磷酸化不會直接中斷Bub3 / DMAP1的相互作用,并且還有另一個未鑒定的成分,例如含有SH2結構域的分子,可以與Bub3競爭,在有絲分裂停滯下與酪氨酸磷酸化的DMAP1相互作用。

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圖3  c-Src磷酸化Tyr246處的DMAP1,干擾Bub3/DMAP1復合物的形成


4、C-Src使DMAP1磷酸化并阻止Bub3 / DMAP1抑制的抗凋亡基因轉錄。

為了研究c-Src介導的DMAP1磷酸化對Bub3 / DMAP1相互作用的抑制作用是否參與有絲分裂后基因轉錄的調控,作者耗竭了SW1990細胞中的內源DMAP1,并重建了RNAi的WT rDMAP1或DMAP1 rY246F的表達。通過cDNA微陣列分析檢查了全局基因表達譜,在表達DMAP1 rY246F的細胞中顯示較低水平的許多轉錄物富含與抗凋亡,炎癥和自噬有關的基因,而在表達DMAP1 rY246F的細胞中顯示較高水平的轉錄物與促凋亡或存活維持相關(圖4b),并認為被DMAP1 Y246F表達下調的基因是Bub3 / DMAP1復合體的潛在靶標。而Bub3 S211A的表達顯著逆轉了DMAP1 Y246F抑制的基因轉錄,同時發現DNMT1消耗消除了DMAP1 Y246F對基因轉錄的抑制作用(圖4c,d)。以上結果結合膜聯蛋白V試驗,表明在有絲分裂脅迫下,Bub3 / DMAP1復合物可作為抗凋亡基因的轉錄抑制因子,其作用在具有高水平DMAP1 pY246的腫瘤細胞中受損。

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圖4 Bub3/DMAP1復合物抑制抗凋亡基因的轉錄


5、C-Src介導的DMAP1磷酸化阻止Bub3 / DMAP1介導的DNA甲基化。

已知DMAP1/DNMT1與哺乳動物的甲基化有關,為了知道DMAP1 pY246在基因轉錄中的抑制作用與其對DNA甲基化的潛在作用有關,作者對WT rDMAP1,DMAP1 rY246F或DMAP1 rY246F加rBub3 S211A的重組表達的SW1990細胞進行了WGBS分析。結果表明,DMAP1 rY246F表達增強了富含CpG和缺乏CpG的啟動子的DNA甲基化(圖5a,左圖)。與其他組相比,具有DMAP1 rY246F表達的細胞組在富含CpG島以及CpG島的海岸上導致了高甲基化的模式(圖5a,右圖)。與WT rDMAP1相比,在具有rDMAP1Y246F表達的SW1990細胞的啟動子下游區域檢測到了CG甲基化的顯著升高,這被rBub3 S211A的伴隨表達顯著逆轉(圖5b)。總的來說,這些結果表明DMAP1 pY246在基因組的整體DNA甲基化中起負作用,而DMAP1-Bub3復合物的形成是特定基因DNA甲基化所必需的。Bub3與有絲分裂阻滯期間的轉錄因子TAp73相關,TAp73耗竭逆轉了用DMAP1 Y246F表達的SW1990細胞中的BCL2L1轉錄,序列分析和ChIP分析表明TAp73在覆蓋有絲分裂結合位點的啟動子區域富集(圖5e)。此外,還發現在SW1990細胞的有絲分裂停滯下,BCL2L1啟動子相關的Bub3,Bub3 S211磷酸化(圖5f)也顯著增加。這些數據表明,TAp73負責啟動子中Bub3和DMAP1復合物的積累,其中Bub3 S211磷酸化對于DMAP1 / DNMT1募集是必不可少的。

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圖5 c- src介導的DMAP1磷酸化可阻斷DMAP1介導的DNA甲基化


6、DMAP1 Y246磷酸化可抵消紫杉醇的體內抗腫瘤活性。

c-Src介導的DMAP1 Y246磷酸化通過抑制有絲分裂阻滯下的Bub3 / DMAP1相互作用來促進腫瘤細胞存活(圖4e),接下來作者通過動物模型確定其在腫瘤發生中的意義。裸鼠實驗表明,具有WT rDMAP1表達的腫瘤細胞仍然能夠通過紫杉醇治療引起快速的腫瘤發生(圖6a和b)。相反,rDMAP1 Y246F的表達很大程度上抑制了腫瘤的生長。但是,rDMAP1 Y246F的抑制作用被rBub3 S211A的共表達所阻斷。這些數據表明DMAP1 Y246磷酸化對Bub3 / DMAP1相互作用的抑制作用促進了腫瘤的發展。為了進一步確定該發現的臨床意義,作者通過免疫印跡和IHC分析了人類胰腺腫瘤標本中DMAP1 pY246的水平,并通過DMAP1 Y246磷酸化水平的高和低評估了患者的生存時間(圖6e),發現那些具有高DMAP1 pY246水平的腫瘤(61例)的中位生存期顯著降低,揭示了DMAP1 Y246磷酸化與人類胰腺癌患者預后不良之間的緊密關系。

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圖6 腫瘤發生需要DMAP1 Y246磷酸化


結論

作者的發現表明,Bub3 / DMAP1復合物對于有絲分裂阻滯后的響應基因表達至關重要,并證明在有絲分裂應激下癌細胞的生存優勢依賴于c-Src對Bub3 / DMAP1介導的凋亡的抑制作用。有絲分裂停止后,Bub3在基因激活中的新作用得到了確認,這為我們提供了一種全新的視角,以了解表觀遺傳修飾因子是如何根據環境信號不斷調節的。另外,c-Src對Bub3/DMAP1/DNMT1軸的抑制作用闡明了癌細胞抵抗有絲分裂應激的關鍵途徑,這一發現為提高c-Src活性上調的抗有絲分裂治療的胰腺癌的治療水平提供了重要的分子基礎。

本研究的WGBS測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

原文索引:

Li, J., Hu, B., Wang, T., Huang, W., Ma, C., Zhao, Q., … Jiang, Y. (2018). C-Src confers resistance to mitotic stress through inhibition DMAP1/Bub3 complex formation in pancreatic cancer. Molecular Cancer, 17(1).doi:10.1186/s12943-018-0919-5  




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